M-MLV Reverse Transcriptase
A na-enweta transcriptase RevScript Reverse site na teknụzụ injinịa mkpụrụ ndụ ihe nketa.O nwere ikike njikọ cDNA dị elu, nkwụsi ike nke okpomọkụ na oke mmeghachi omume okpomọkụ (ruo 60 Celsius).Ngwaahịa cDNA arụkọtara ruru 10 kb.Ọ na-eme ka njikọ nke ndebiri ahụ dịkwuo mma ma dabara adaba maka ntụgharị ederede RNA nwere nhazi nke abụọ dị mgbagwoju anya ma ọ bụ mkpụrụ ndụ ihe nketa dị ala.
Ngwa
| Akụkụ | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| Ntugharị ntụgharị ntụgharị (200U/μL) | 50 μl | 5 × 50 μl | 1 ml |
| 5 × Nchekwa Mkpu | 250 μl | 1.25 ml | 5 ml |
Ọnọdụ Nchekwa
Ekwesịrị ịchekwa ngwaahịa a na -25°C ~ -15°C maka afọ 2.
Nkọwa nkeji
Otu nkeji na-etinye 1 nmol nke dTTP n'ime ihe anaghị edozi acid n'ime nkeji 10 na 37ºC na-eji Oligo(dT) dị ka primers.
Ntọala mmeghachi omume
1.Denaturation nke RNA template (nzọụkwụ a bụ nhọrọ, denaturation nke RNA template na-enyere aka imeghe ụlọ nke abụọ, nke ga-eme ka mkpụrụ nke mbụ strand cDNA.)
| Ngwa | Olu (μL) |
| RNase ddH efu2O | ruo 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) ma ọ bụ Random Primer (50 μmol/L) Ma ọ bụ Gene Specific Primers (2 μmol/L) | 1 |
| ma ọ bụ 1 | |
| ma ọ bụ 1 | |
| RNA template | X a |
ndetu:
1) a: Mkpokọta RNA: 1-5 ug ma ọ bụ mRNA: 1-500 ng
2) Incubating na 65 Celsius C maka nkeji 5, wee bufee na ice ozugbo ka ọ dị jụụ maka nkeji 2.Obere centrifugation iji nakọta mmiri mmiri mmeghachi omume, gbakwunye azịza nzaghachi ntụgharị ntụgharị dịka egosiri na tebụl na-esote.Jiri nwayọọ pipette gwakọta.
1.Nkwadebe ngwakọta mmeghachi omume (olu 20 μL)
| Ngwa | Olu (μL) |
| Ngwakọta nke nzọụkwụ gara aga | 13 |
| 5 × nchekwa | 4 |
| Ngwakọta dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Ntugharị ntụgharị (200 U/μL) | 1 |
| Ihe mgbochi RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Mee mmeghachi omume n'okpuru ọnọdụ ndị a:
| Okpomọkụ (°C) | Oge |
| 25 Celsius Ca | 5mins |
| 42 Celsius Cb | 15-30 nkeji |
| 85 Celsius Cc | 5mins |
ndetu:
1) a.Ịkwalite na 25 Celsius C maka nkeji 5 ka achọrọ naanị maka iji hexamers enweghị usoro.Biko hapụ nzọụkwụ a mgbe ị na-eji Oligo (dT)18ma ọ bụ Gene Specific Primer.
2) b.Okpomọkụ ntụgharị ntụgharị akwadoro bụ 42°C, Maka ndebiri nwere ihe owuwu nke abụọ gbagwojuru anya ma ọ bụ ọdịnaya GC dị elu, a na-atụ aro ka ebuli okpomọkụ mmeghachi omume na 50-55°C.
3) c.Na-ekpo ọkụ na 85 Celsius C maka nkeji 5 ka ọ ghara imegharị transcriptase.
4) Enwere ike iji ngwaahịa ahụ ozugbo na mmeghachi omume PCR ma ọ bụ qPCR, ma ọ bụ chekwaa ya na -20 Celsius maka nchekwa obere oge.A na-atụ aro ka ị gbanwee ngwaahịa ma chekwaa na -80 Celsius maka nchekwa ogologo oge.Zere na-agbaze oyi mgbe niile.
5) Ngwaahịa ahụ dabara maka otu nzọụkwụ RT-qPCR, a na-atụ aro ka ịgbakwunye 10-20 U reverse transcriptase maka usoro mmeghachi omume 25μL ọ bụla, ma ọ bụ jiri nwayọọ nwayọọ na-abawanye ọnụọgụ ntụgharị dị ka ọnọdụ dị adị.
Ihe ndetu
1.Biko dobe ebe nnwale ahụ ọcha;Ekwesịrị iyi uwe aka na ihe mkpuchi dị ọcha mgbe a na-arụ ọrụ.Ngwa niile eji eme nnwale kwesịrị ịbụ RNase n'efu iji gbochie mmetọ RNase.
2.Ekwesịrị ịme usoro niile na ice iji gbochie mmebi RNA.
3.A na-atụ aro ihe nlele RNA dị elu iji hụ na arụmọrụ dị elu nke ntụgharị ntụgharị.
4.Ngwaahịa a bụ naanị maka nyocha.
5.Biko rụọ ọrụ na uwe lab na uwe mwụfu, maka nchekwa gị.
