M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase bụ ntụgharị ntụgharị nke enwetara site na nyocha ngbanwe nke mkpụrụ ndụ M-MLV nke Moloney murine leukemia nje sitere na nkwupụta na E.coli.Enzyme ahụ na-ewepụ ọrụ RNase H, nwere oke nnabata okpomọkụ, ma dabara maka ntụgharị ihu okpomọkụ dị elu.Ya mere, ọ na-enye aka maka iwepụ mmetụta na-adịghị mma nke nhazi ọkwa dị elu nke RNA na ihe ndị na-adịghị akọwapụta na njikọ cDNA, ma nwee nkwụsi ike dị elu ma na-atụgharị ikike nchịkọta ederede.Enzyme ahụ nwere nkwụsi ike dị elu yana ikike njikọ ntụgharị ntụgharị.
Ngwa
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Ihe nchekwa eriri mbụ (nhọrọ)
* 5 × First-Strand Buffer enweghị dNTP, biko tinye dNTP mgbe ị na-akwado sistemu mmeghachi omume.
Ngwa akwadoro
1.Otu nzọụkwụ qRT-PCR.
2.nchọpụta nje RNA.
Ọnọdụ Nchekwa
-20ºC maka nchekwa ogologo oge, ekwesịrị ịgwakọta nke ọma tupu ejiri ya, zere ịza oyi mgbe niile.
Nkọwa nkeji
Otu nkeji na-etinye 1 nmol nke dTTP n'ime nkeji iri na 37°C na-eji poly(A)•oligo(dT)25dị ka template/primer.
Njikwa ogo
1.SDS-PAGE electrophoretic dị ọcha karịa 98%.
2.Mmetụta mmụba, njikwa batch-to-batch, nkwụsi ike.
3.Ọ dịghị ọrụ nuclease exogenous, ọ dịghị exogenous endonuclease ma ọ bụ exonuclease mmetọ
Ntọlite mmeghachi omume maka Ngwọta mmeghachi omume Chain Mbụ
1.Nkwadebe nke ngwakọta mmeghachi omume
| Ngwa | Olu |
| Oligo(dT)12-18 Ihe mbụ ma ọ bụ Random Primera Ma ọ bụ Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Ụdị RNA | Ngụkọta RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH na-enweghị RNase2O | Maka 10 μl |
ndetu:a/b: Biko họrọ ụdị primers dị iche iche dịka mkpa nnwale gị siri dị.
2.Kpoo ọkụ na 65ºC maka nkeji 5 wee dị jụụ ngwa ngwa na ice maka nkeji 2.
3.Tinye ihe ndị a na sistemu dị n'elu na mkpokọta 20µL wee gwakọta nwayọ:
| Ngwa | Olu (μL) |
| 5 × Ihe nchekwa eriri mbụ | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Ihe mgbochi RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH na-enweghị RNase2O | Maka 20 μl |
4.Biko mee mmeghachi omume dịka ọnọdụ ndị a:
(1) Ọ bụrụ na Random Primer na-eji, mmeghachi omume kwesịrị rụrụ na 25 ℃ maka 10mins, na mgbe ahụ na 50 ℃ maka 30 ~ 60mins;
(2) Ọ bụrụ na Oligo dT ma ọ bụ kpọmkwem primers na-eji, mmeghachi omume kwesịrị rụrụ na 50 ℃ maka 30 ~ 60mins.
5.Kpoo ọkụ na 95 ℃ maka nkeji 5 ka ọ kwụsị ọrụ Neoscript Reverse Transcriptase wee kwụsị mmeghachi omume ahụ.
6.Enwere ike iji ngwaahịa ntụgharị ntụgharị ozugbo na mmeghachi omume PCR na mmeghachi omume PCR fluorescence quantitative, ma ọ bụ chekwaa na -20 ℃ ruo ogologo oge.
PCR Romume:
1.Nkwadebe nke ngwakọta mmeghachi omume
| Ngwa | Ntinye uche |
| 10 × PCR nchekwa (dNTP efu, Mg²+ n'efu) | 1× |
| dNTP (10mM dNTP ọ bụla) | 200 μM |
| 25 mmMgCl2 | 1-4 mm |
| DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Nke mbụ 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Nke mbụ 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Ụdịa | ≤10% Ngwọta mmeghachi omume nke mbụ (2 μL) |
| ddH2O | Maka 50 μl |
ndetu:a: Ọ bụrụ na agbakwunyere ihe ngwọta mmeghachi omume mbụ nke ukwuu, enwere ike igbochi mmeghachi omume PCR.
2.Usoro mmeghachi omume PCR
| Nzọụkwụ | Okpomọkụ | Oge | okirikiri |
| Tupu denaturation | 95 ℃ | 2-5 nkeji | 1 |
| Denaturation | 95 ℃ | 10-20 nkeji | 30-40 |
| Na-ewe iwe | 50-60 ℃ | 10-30 nkeji | |
| Mgbatị | 72 ℃ | 10-60 nkeji |
Ihe ndetu
1.Kwesịrị ekwesị maka njikarịcha okpomọkụ ntụgharị ntụgharị na oke nke 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Ọ nwere nkwụsi ike ka mma, dabara adaba maka mmụba ntụgharị ntụgharị okpomọkụ dị elu.Na mgbakwunye, ọ dị mma maka ịgafe nke ọma na mpaghara RNA dị mgbagwoju anya.Ọzọkwa, ọdabara adaba maka otu nzọụkwụ multiplex fluorescence quantitative RT-PCR nchọpụta.
3.Ndakọrịta dị mma na enzymes mmụba PCR dị iche iche ma dabara maka mmeghachi omume RT-PCR dị elu.
4.Kwesịrị ekwesị maka mmetụta uche dị elu otu nzọụkwụ fluorescence quantitative RT-PCR mmeghachi omume, na-emeziwanye ọnụọgụ nchọpụta dị ala nke ndebiri.
5.Kwesịrị ekwesị maka iwu ụlọ ọba akwụkwọ cDNA.
